近日，真邁生物與合作單位華中農業大學(xué)農業微生物學(xué)國家重點實驗室在Journal of Applied Microbiology上發表了題為(wèi)“Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis”的(de)研究成果。該研究基于GenoLab M高(gāo)通量基因測序儀完成了堿性蛋白酶的(de)高(gāo)産菌株Bacillus licheniformis AQ在50 L發酵罐全過程（8個時間段）的(de)轉錄組測序以解析其高(gāo)表達堿性蛋白酶機制。在發酵終點（48 h)時，堿性蛋白酶達到峰值（42,020 U/mL），其他時間點與這個時間點比較，得到各組差異表達基因。随後取其各組差異表達基因的(de)交集，得到61個基因，對它們的(de)功能分析發現：這些基因的(de)編碼蛋白主要參與了分解代謝過程、肽酶和(hé)抑制劑、伴侶和(hé)折疊催化等過程。
堿性蛋白酶(AprE)是一(yī)種重要的(de)工業酶，廣泛應用于食品加工、洗滌劑工業、皮革業、生物轉化反應、廢物處理(lǐ)、生物活性肽合成等領域。在全球範圍內(nèi)，AprE占據了50%以上的(de)酶産業。然而，目前的(de)AprE産量仍然不能滿足工業需求，導緻了大規模工業酶短(duǎn)缺。因此，進一(yī)步提高(gāo)AprE産率具有廣闊的(de)工業應用前景。很多微生物都能合成AprE，而其中芽孢杆菌屬Bacillus具有明顯優勢，它們屬于公認安全菌株，其蛋白分泌能力強，易于培養，發酵周期短(duǎn)，工業發酵穩健性強，基因修飾方便，例如(rú)B. licheniformis，可(kě)以敲除調控因子(zǐ)sig F，阻止芽孢形成，使得AprE的(de)酶活提升20%，達到29,494 ± 1053 U/mL。安琪酵母股份有限公司擁有一(yī)株高(gāo)産AprE的(de)菌株，B. licheniformis AQ，本次采集了50 L大罐發酵的(de)8個重要時間點樣本測定了AprE的(de)酶活等理(lǐ)化指标，并提取RNA完成轉錄組測序。
01 AprE發酵過程中的(de)基因表達模式
該研究的(de)8份樣本轉錄組測序，一(yī)共得到242 M高(gāo)質量reads，檢測到3821個基因在發酵過程中表達，占菌株總基因的(de)91.74%。顯然，發酵終點(48 h)時高(gāo)表達基因最多(a)。由于AprE酶活在發酵終點(48 h)時最高(gāo)，因此，以48 h作為(wèi)對照，進行差異表達基因（DEG）分析，24 h時DEG數目最多，其次是32 h(b)。七個比較組的(de)DEG的(de)交集一(yī)共涉及61個基因(c)。通過功能富集分析發現這61個基因主要參與生物過程，尤其是氨基酸、α -氨基酸、有機酸、有機氮化合物等衆多分解代謝過程(d)。而肽酶和(hé)抑制劑、伴侶蛋白和(hé)折疊催化(KEGG)和(hé)胞外區域(GO_Cellular component)等功能富集最為(wèi)顯著。DEG中最多的(de)功能是肽酶和(hé)抑制劑。高(gāo)效的(de)蛋白分泌和(hé)折疊是芽孢杆菌重組蛋白生産的(de)關鍵。這些過程由轉運系統的(de)組分以及細胞內(nèi)和(hé)胞質外的(de)伴侶蛋白輔助完成。這部分富集分析結果也證實了在AprE發酵過程中分泌和(hé)折疊活性非常活躍。
02 AprE發酵過程中的(de)潛在調控網絡
研究人員查閱文獻，并結合轉錄組測序結果，一(yī)共挑選了30個蛋白，它們可(kě)能與AprE合成相關，通過與STRING數據庫進行分析，繪制PPI（蛋白相互作用）網絡，最終得到了22個蛋白的(de)網絡信息。Spo0A位于中心，擁有節點數最多(11個)，其次是CodY (9個)、sigH (9個)和(hé)ArbB (8個)。而這些蛋白的(de)編碼基因表達量熱圖顯示，AprE基因的(de)表達量在24 h達到峰值，随後下降，在32 h達到第二高(gāo)峰，随後下降，發酵結束時略有上升。右下5個sigma因子(zǐ)的(de)表達模式與AprE略有不同。
03 qRT-PCR驗證轉錄組表達量
研究人員挑選了與AprE合成相關的(de)20個關鍵基因進行qRT-PCR驗證，包括芽孢形成的(de)16個調控基因，4個全局調控基因。qRT-PCR數據顯示：大多數基因在32 h時表達水平較高(gāo)。而轉錄組數據顯示大部分基因在24 h時表達水平較高(gāo)，但未檢測到qRT-PCR數據。雖然qRT-PCR與RNA-seq數據存在一(yī)定差異，但大部分基因的(de)表達趨勢是一(yī)緻的(de)，證明了轉錄組數據的(de)可(kě)靠性。
1. 該研究首先考察了B. licheniformis AQ在工業發酵過程中不同時間點堿性蛋白酶的(de)變化。結果表明，發酵過程中堿性蛋白酶不斷積累，在發酵48 h時達到最大值；
2. 發酵全過程的(de)轉錄組測序結果顯示：表達量最高(gāo)的(de)基因在發酵結束時(48 h)最多；
3. 構建了潛在的(de)PPI網絡，并利用qRT-PCR技術對AprE發酵過程中關鍵基因的(de)表達水平進行了驗證。
Ji A, Zheng X, Yang W, et al. Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis[J]. Journal of Applied Microbiology, 2023: lxad319.