近日，真邁生物與合作單位上海交通大學(xué)醫學(xué)院附屬第一(yī)人民醫院在Frontiers in Genetics的(de)Genomic Assay Technology版塊上發表了題為(wèi)“Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers”的(de)研究成果。該研究涵蓋了兩種腫瘤panel：TSO500和(hé)TargetSeq One；三種典型樣本：FFPE，cf DNA（cell-free DNA） 和(hé)cell line；六個主流的(de)NGS測序平台：NovaSeq 6000，NextSeq 550，MGISEQ 2000，GenoLab M，FASTASeq 300，SURFSeq 5000；五種常用的(de)突變分析軟件：HaplotypeCaller，Mutect2，SiNVICT，SNVer和(hé)VarScan 2。
靶向基因組測序(TS)是一(yī)種有效的(de)高(gāo)通量測序(NGS)方法，重點關注與疾病發病機制或臨床相關的(de)一(yī)組基因或靶點。它通過快速檢測基因變異，為(wèi)臨床醫生提供參考，幫助他們解釋病人基因圖譜，并為(wèi)實施個性化的(de)抗癌提供建議，極大地(dì)促進了腫瘤精準化的(de)發展。
TSO500是一(yī)個全面的(de)靶标測序panel，涵蓋超過8種癌症類型和(hé)523種癌症相關基因(1.94 Mb)，用于捕獲FFPE标準品HD832，而TargetSeq One kit 用于富集Twist cf DNA。本研究中，6個乳腺癌和(hé)卵巢癌的(de)cell line的(de)panel數據來自(zì)于公開數據庫SRA。
TSO500靶向測序平台與軟件間的(de)比較
如(rú)圖1a和(hé)1b所示，NovaSeq 6000，NextSeq 550，GenoLab M和(hé)FASTASeq 300四個測序平台在SNP和(hé)InDel檢測的(de)靈敏度（sensitivity）方面表現出幾乎一(yī)緻的(de)結果，雖然SiNVICT和(hé)Mutect2在InDel的(de)calling上有一(yī)些細微差異。FASTASeq 300測序儀基于SNVer和(hé)VarScan2軟件，可(kě)以檢出樣本中全部的(de)SNP和(hé)InDel突變（sensitivity=100%）。對于F-score和(hé)精确度（precision），SNVer和(hé)VarScan2在SNP和(hé)InDel檢測上也表現最好。此外，與ddPCR驗證的(de)真集相比，四個測序平台一(yī)緻性都比較高(gāo)，特别是使用SNVer和(hé)VarScan2兩個分析工具(1c）。
Pearson相關系數(r)熱圖(圖1d)顯示，在相同的(de)軟件下，不同測序平台呈現出相似的(de)整體性能。随後，研究者比較了不同測序平台與分析軟件間高(gāo)置信度變異的(de)檢測數量(圖1e)，發現所有數據集的(de)一(yī)緻性高(gāo)達93.4%(198/212)。其中，FASTASeq 300能檢測到更多的(de)特有突變，特别是通過SNVer和(hé)VarScan2兩個軟件。
綜上，在SNP和(hé)InDel的(de)突變檢出方面，分析軟件間比測序平台間表現出的(de)差異更大，FASTASeq 300在SNVer和(hé)VarScan2軟件下表現更優。
一(yī)般而言，測序深度的(de)增加有助于變異檢測結果的(de)重現和(hé)低(dī)頻突變的(de)檢出，但需要更長(cháng)的(de)分析時間、更高(gāo)的(de)計算複雜度以及成本。研究者以突變檢出表現最好的(de)FASTASeq 300測序平台和(hé)SNVer以及VarScan2兩款軟件為(wèi)研究重點，比較了不同測序深度下變異檢測時間、內(nèi)存使用、SNP和(hé)InDel檢測靈敏度的(de)差異，期望探索到保證高(gāo)靈敏度的(de)情況下所需的(de)最低(dī)測序深度(圖1f和(hé)1g，結果表明：至少500x的(de)測序深度可(kě)以保證全部突變的(de)檢出，而VarScan2軟件消耗內(nèi)存更少，運行時間更短(duǎn)）。
TargetSeq One捕獲的(de)cf DNA測序平台與分析軟件的(de)比較
對于cf DNA樣本，軟件SNVer和(hé)VarScan2在SNP和(hé)InDel檢測方面表現出色。F-score, 召回率（recall）和(hé)精确度都接近100% (Fig. S2)，三個測序平台NovaSeq 6000，MGISEQ 2000和(hé)SURFSeq 5000結果也很一(yī)緻。
cell line樣本的(de)分析軟件比較
通過下載公開數據集，研究者獲取到3個乳腺癌和(hé)3個卵巢癌的(de)panel測序結果，并使用上述五款軟件進行突變檢測，結果表明：SNVer和(hé)VarScan2兩款軟件同樣表現更優，其檢測結果最接近真集。
不同測序平台在同一(yī)個分析軟件下，突變檢測的(de)一(yī)緻性較好。三種類型的(de)腫瘤樣本，在突變檢測方面，SNVer和(hé)VarScan2均表現最優。該項研究為(wèi)腫瘤靶向測序提供了一(yī)個benchmark。該研究使用五種軟件對三種典型的(de)腫瘤樣本進行變異檢測的(de)性能評估，也為(wèi)未來腫瘤變異研究提供了有價值的(de)參考。
Feng B, Lai J, Fan X, et al. Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers[J]. Frontiers in Genetics, 2023, 14: 1293974.